Izdelki
Komplet za detekcijo virusa SARS-Cov-2-RT-PCR Lifecosm za 2019-nCoV
Pričakovana uporaba
Ta komplet se uporablja za kvalitativno odkrivanje novega koronavirusa (2019-nCoV) z uporabo brisov grla, brisov nosno-žrelnega odvzema, bronhoalveolarne lavažne tekočine in sputuma. Rezultat odkrivanja s tem izdelkom je namenjen le klinični referenci in se ne sme uporabljati kot edini dokaz za klinično diagnozo in zdravljenje. Priporočljiva je celovita analiza stanja v kombinaciji s kliničnimi manifestacijami bolnika in drugimi laboratorijskimi testi.
Načelo pregleda
Komplet temelji na enostopenjski tehnologiji RT-PCR. Pravzaprav sta bila kot ciljna območja amplifikacije izbrana gena ORF1ab in N novega koronavirusa 2019 (2019-nCoV). Specifični primerji in fluorescentne sonde (sonde gena N so označene s FAM, sonde ORF1ab pa s HEX) so zasnovane za odkrivanje RNA koronavirusa novega tipa 2019 v vzorcih. Komplet vključuje tudi endogeni sistem za detekcijo notranje kontrole (sonda gena notranje kontrole, označena s CY5) za spremljanje procesa odvzema vzorcev, amplifikacije RNA in PCR, s čimer se zmanjšajo lažno negativni rezultati.
Glavne komponente
| Komponente | Glasnost(48T/Komplet） |
| Reakcijska raztopina RT-PCR | 96 µl |
| nCOV primer TaqMan mešanica sonde（ORF1ab, gen N, gen RnaseP） | 864 µl |
| Negativna kontrola | 1500 µl |
| Pozitivna kontrola nCOV（l gen ORF1ab N） | 1500 µl |
Lastni reagenti: reagenti za ekstrakcijo ali čiščenje RNA. Negativna/pozitivna kontrola: Pozitivna kontrola je RNA, ki vsebuje ciljni fragment, negativna kontrola pa je voda brez nukleinskih kislin. Med uporabo morajo sodelovati pri ekstrakciji in jih je treba šteti za kužne. Z njimi je treba ravnati in jih odstraniti v skladu z ustreznimi predpisi.
Notranji referenčni gen je človeški gen RnaseP.
Pogoji shranjevanja in rok uporabnosti
-20±5 ℃, izogibajte se ponovnemu zamrzovanju in odtajanju več kot 5-krat, veljavno 6 mesecev.
Uporabni instrument
Z FAM / HEX / CY5 in drugimi večkanalnimi fluorescentnimi PCR instrumenti.
Zahteve glede vzorcev
1. Uporabne vrste vzorcev: brisi grla, brisi nosno-žrelnega prostora, bronhoalveolarna lavaža, sputum.
2. Odvzem vzorca (aseptična tehnika)
Faringealni bris: Tonzile in zadnjo steno žrela obrišite z dvema brisoma hkrati, nato pa glavo brisa potopite v epruveto z raztopino za vzorčenje.
Izpljunek: Ko bolnik globoko zakašlja, zberite izkašljani izpljunek v epruveto z navojnim zamaškom, ki vsebuje raztopino za vzorčenje; bronhoalveolarna lavaža: Vzorčenje opravijo zdravstveni delavci. 3. Shranjevanje in transport vzorcev
Vzorce za izolacijo virusa in testiranje RNA je treba testirati čim prej. Vzorce, ki jih je mogoče zaznati v 24 urah, lahko shranite pri 4 ℃; tiste, ki jih ni mogoče zaznati v 24 urah,
ure je treba shranjevati pri -70 ℃ ali manj (če ni pogojev shranjevanja pri -70 ℃, jih je treba
začasno shranjeno pri -20 ℃ v hladilniku). Vzorcev se je treba med prevozom izogibati ponovnemu zamrzovanju in odtajanju. Vzorce je treba čim prej po odvzemu poslati v laboratorij. Če je treba vzorce prevažati na dolge razdalje, je priporočljivo shranjevanje v suhem ledu.
Preskusne metode
1 Obdelava vzorcev in ekstrakcija RNA (območje obdelave vzorcev)
Priporočljivo je, da za ekstrakcijo RNA vzamete 200 μl tekočega vzorca. Za povezane korake ekstrakcije glejte navodila komercialnih kompletov za ekstrakcijo RNA. Tako negativni kot negativni
Kontrole v tem kompletu so bile vključene v ekstrakcijo.
2 Priprava reagenta za PCR (območje za pripravo reagenta)
2.1 Vse komponente odstranite iz kompleta, jih odtajajte in premešajte pri sobni temperaturi. Pred uporabo centrifugirajte pri 8000 vrt/min nekaj sekund; izračunajte potrebno količino reagentov in reakcijski sistem pripravite, kot je prikazano v naslednji tabeli:
| Komponente | N porcija (25 µl sistem) |
| nCOV primer TaqMan mešanica sonde | 18 µl × N |
| Reakcijska raztopina RT-PCR | 2 µl × N |
| *N = število testiranih vzorcev + 1 (negativna kontrola) + 1 (nCOVpozitivna kontrola) | |
2.2 Po temeljitem mešanju komponent na kratko centrifugirajte, da se vsa tekočina na steni epruvete steče na dno epruvete, nato pa v PCR epruveto vnesite alikvotni delež 20 µl amplifikacijskega sistema.
3 Vzorčenje (območje za pripravo vzorcev)
Po ekstrakciji dodajte 5 μl negativne in pozitivne kontrole. RNA vzorca, ki ga želite testirati, dodajte v reakcijsko epruveto PCR.
Epruveto tesno zaprite in jo nekaj sekund centrifugirajte pri 8000 vrt/min, preden jo prenesete v območje za detekcijo amplifikacije.
4 PCR amplifikacija (amplificirano območje detekcije)
4.1 Reakcijsko epruveto postavite v vzorčno celico instrumenta in nastavite naslednje parametre:
| oder | Kolo številka | Temperatura(°C) | Čas | zbirkaspletno mesto |
| Obrnjenoprepisovanje | 1 | 42 | 10 minut | - |
| Preddenaturacijan | 1 | 95 | 1 minuta | - |
| Kolo | 45 | 95 | 15-ih | - |
| 60 | 30. leta | zbiranje podatkov |
Izbira kanala za zaznavanje instrumenta: Za fluorescenčni signal izberite kanale FAM, HEX in CY5. Za referenčni fluorescenčni signal NONE ne izberite ROX.
5 Analiza rezultatov (Za nastavitev glejte navodila za uporabo posameznega instrumenta)
Po reakciji shranite rezultate. Po analizi prilagodite začetno vrednost, končno vrednost in pragovno vrednost osnovne linije glede na sliko (uporabnik lahko prilagodi glede na dejansko situacijo, začetno vrednost je mogoče nastaviti na 3~15, končno vrednost pa na 5~20) v logaritemskem grafu. Pri pragu okna je pragovna črta v logaritemski fazi, krivulja amplifikacije negativne kontrole pa je ravna črta ali pod pragovno črto.
6. Kontrola kakovosti (v test je vključena tudi kontrolna procedura). Negativna kontrola: brez očitne krivulje amplifikacije za detekcijske kanale FAM, HEX in CY5.
Pozitivna kontrola COV: očitna krivulja amplifikacije detekcijskih kanalov FAM in HEX, vrednost Ct ≤ 32, vendar ni krivulje amplifikacije kanala CY5;
Zgornje zahteve morajo biti izpolnjene hkrati v istem poskusu, sicer je poskus neveljaven in ga je treba ponoviti.
7 Določanje rezultatov.
7.1 Če v kanalih FAM in HEX testnega vzorca ni krivulje amplifikacije ali je vrednost Ct > 40, v kanalu CY5 pa je krivulja amplifikacije, lahko sklepamo, da v vzorcu ni RNA novega koronavirusa 2019 (2019-nCoV);
.2 Če ima testni vzorec očitne krivulje amplifikacije v kanalih FAM in HEX in je vrednost Ct ≤40, lahko sklepamo, da je vzorec pozitiven na novi koronavirus 2019 (2019-nCoV).
7.3 Če ima testni vzorec jasno krivuljo amplifikacije samo v enem kanalu FAM ali HEX, vrednost Ct pa je ≤40, v drugem kanalu pa ni krivulje amplifikacije, je treba rezultate ponovno testirati. Če so rezultati ponovnega testiranja skladni, se lahko vzorec oceni kot pozitiven za novi test.
koronavirus 2019 (2019-nCoV). Če je rezultat ponovnega testiranja negativen, se lahko sklepa, da je vzorec negativen na novi koronavirus 2019 (2019-nCoV).
Pozitivna vrednost presoje
Za določitev referenčne vrednosti CT kompleta se uporablja metoda ROC krivulje, referenčna vrednost notranje kontrole pa je 40.
Interpretacija rezultatov testov
1. Vsak poskus je treba preizkusiti glede negativnih in pozitivnih kontrol. Rezultate testov je mogoče določiti le, če kontrole izpolnjujejo zahteve glede nadzora kakovosti.
2. Ko sta detekcijska kanala FAM in HEX pozitivna, je lahko rezultat kanala CY5 (kanal notranjega krmiljenja) negativen zaradi sistemske konkurence.
3. Če je rezultat notranje kontrole negativen in sta tudi detekcijska kanala FAM in HEX v epruveti negativna, to pomeni, da je sistem onemogočen ali da je delovanje napačno, test pa je neveljaven. Zato je treba vzorce ponovno testirati.
