Izdelki
Lifecosm komplet za odkrivanje SARS-Cov-2-RT-PCR za 2019-nCoV
Pričakovana poraba
Ta komplet se uporablja za kvalitativno odkrivanje novega koronavirusa (2019-nCoV) z uporabo brisov žrela, nazofaringealnih brisov, bronhoalveolarne tekočine za izpiranje, sputuma. Rezultat odkrivanja tega izdelka je samo za klinično referenco in se ne sme uporabljati kot edini dokaze za klinično diagnozo in zdravljenje. Priporočljiva je celovita analiza stanja v kombinaciji s kliničnimi manifestacijami bolnika in drugimi laboratorijskimi preiskavami.
Načelo inšpekcije
Komplet temelji na enostopenjski RT-PCR tehnologiji.Pravzaprav so bili geni ORF1ab in N novega koronavirusa iz leta 2019 (2019-nCoV) izbrani kot ciljne regije pomnoževanja.Specifični primerji in fluorescentne sonde (sonde genov N so označene s FAM in sonde ORF1ab so označene s HEX) so zasnovane za odkrivanje RNK novega tipa koronavirusa 2019 v vzorcih.Komplet vključuje tudi sistem za zaznavanje endogenega notranjega nadzora (sonda gena za notranji nadzor, označena s CY5) za spremljanje postopka zbiranja vzorcev, pomnoževanja RNA in PCR, s čimer se zmanjša število lažno negativnih rezultatov.
Glavne komponente
| Komponente | Glasnost（48T/Komplet） |
| Reakcijska raztopina RT-PCR | 96 µl |
| nCOV primer TaqMan mešanica sonde（ORF1ab, gen N, gen RnaseP） | 864 µl |
| Negativna kontrola | 1500µl |
| Pozitivna kontrola nCOV（l gen ORF1ab N） | 1500µl |
Lastni reagenti: reagenti za ekstrakcijo ali čiščenje RNA.Negativna/pozitivna kontrola: Pozitivna kontrola je RNA, ki vsebuje ciljni fragment, medtem ko je negativna kontrola voda brez nukleinske kisline.Med uporabo morajo sodelovati pri ekstrakciji in jih je treba obravnavati kot kužne.Z njimi je treba ravnati in jih odstraniti v skladu z ustreznimi predpisi.
Notranji referenčni gen je človeški gen RnaseP.
Pogoji shranjevanja in rok uporabnosti
-20±5℃, izogibajte se ponovnemu zamrzovanju in odmrzovanju več kot 5-krat, velja 6 mesecev.
Uporabni instrument
Z FAM / HEX / CY5 in drugimi večkanalnimi fluorescenčnimi PCR instrumenti.
Zahteve za vzorce
1. Veljavne vrste vzorcev: brisi žrela, nazofaringealni brisi, bronhoalveolarna izpiralna tekočina, sputum.
2. Zbiranje vzorcev (aseptična tehnika)
Žrelni bris: obrišite mandlje in zadnjo faringealno steno z dvema tamponoma hkrati, nato pa glavo brisa potopite v epruveto z raztopino za vzorčenje.
Izpljunek: Ko ima bolnik globok kašelj, zberite izkašljani izpljunek v epruveto z navojnim pokrovčkom, ki vsebuje raztopino za vzorčenje;tekočina za bronhoalveolarni lavage: vzorčenje s strani zdravstvenih delavcev.3. Shranjevanje in transport vzorcev
Vzorce za izolacijo virusa in testiranje RNA je treba testirati čim prej.Vzorce, ki jih je mogoče zaznati v 24 urah, lahko shranite pri 4 ℃;tistih, ki jih ni mogoče zaznati v 24
ure morajo biti shranjene pri -70 ℃ ali manj (če ni pogojev shranjevanja pri -70 ℃, jih je treba
začasno shranjeno pri -20 ℃ v hladilniku).Vzorci naj se med prevozom izogibajo ponavljajočemu se zamrzovanju in odmrzovanju.Vzorce je treba poslati v laboratorij čim prej po odvzemu.Če je treba vzorce prevažati na dolge razdalje, priporočamo shranjevanje suhega ledu.
Preskusne metode
1 Obdelava vzorca in ekstrakcija RNK (območje obdelave vzorca)
Za ekstrakcijo RNA je priporočljivo vzeti 200 μl tekočega vzorca.Za povezane korake ekstrakcije glejte navodila komercialnih kompletov za ekstrakcijo RNK.Tako negativno kot negativno
kontrole v tem kompletu so bile vključene v ekstrakcijo.
2 Priprava reagenta PCR (območje za pripravo reagenta)
2.1 Odstranite vse komponente iz kompleta ter odmrznite in premešajte pri sobni temperaturi.Pred uporabo nekaj sekund centrifugirajte pri 8000 obratih na minuto;izračunajte potrebno količino reagentov in reakcijski sistem pripravite, kot je prikazano v naslednji tabeli:
| Komponente | N porcija (25µl sistem) |
| nCOV primer TaqMan mešanica sonde | 18 µl × N |
| Reakcijska raztopina RT-PCR | 2 µl × N |
| *N = število testiranih vzorcev + 1 (negativna kontrola) + 1 (nCOVpozitivna kontrola) | |
2.2 Po temeljitem mešanju komponent za kratek čas centrifugirajte, da vsa tekočina s stene epruvete pade na dno epruvete, nato pa alikvotirajte 20 µl pomnoževalni sistem v epruveto za PCR.
3 Vzorčenje (območje priprave vzorca)
Po ekstrakciji dodajte 5 μl negativne in pozitivne kontrole.RNK vzorca za testiranje se doda v reakcijsko epruveto PCR.
Epruveto tesno zaprite in nekaj sekund centrifugirajte pri 8000 obratih na minuto, preden jo prenesete v območje zaznavanja ojačanja.
4 PCR pomnoževanje (pomnoženo območje zaznavanja)
4.1 Postavite reakcijsko epruveto v vzorčno celico instrumenta in nastavite parametre, kot sledi:
| stopnja | Cikel število | Temperatura(°C) | Čas | zbirkamesto |
| Vzvratnoprepisovanje | 1 | 42 | 10 min | - |
| Preddenaturacijan | 1 | 95 | 1 min | - |
| Cikel | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | 30-ih let | Zbiranje podatkov |
Izbira kanala za zaznavanje instrumenta: izberite kanal FAM、HEX、CY5 za fluorescenčni signal.Za referenčno fluorescentno NI, prosimo, ne izberite ROX.
5 Analiza rezultata (za nastavitev glejte eksperimentalna navodila vsakega instrumenta)
Po reakciji shranite rezultate.Po analizi prilagodite začetno vrednost, končno vrednost in mejno vrednost osnovne črte glede na sliko (uporabnik se lahko prilagodi glede na dejansko stanje, začetno vrednost lahko nastavite na 3~15, končno vrednost lahko nastavite na 5~20, prilagoditev) v logaritemskem grafu Na pragu okna je črta praga v logaritemski fazi, krivulja ojačanja negativne kontrole pa je ravna črta ali pod črto praga).
6 Kontrola količine（Proceduralna kontrola je vključena v test） Negativna kontrola: Ni očitne krivulje ojačanja za kanale zaznavanja FAM, HEX, CY5n
Pozitivna kontrola COV: očitna pomnoževalna krivulja kanalov zaznavanja FAM in HEX, vrednost Ct≤32, vendar brez pomnožitvene krivulje kanala CY5;
Zgornje zahteve morajo biti izpolnjene sočasno v istem poskusu;sicer je poskus neveljaven in ga je treba ponoviti.
7 Določitev rezultatov.
7.1 Če v kanalih FAM in HEX testnega vzorca ni pomnožitvene krivulje ali vrednosti Ct> 40 in je pomnožitvena krivulja v kanalu CY5, se lahko oceni, da ni novega koronavirusa 2019 (2019-nCoV) RNA v vzorcu;
.2 Če ima testni vzorec očitne pomnoževalne krivulje v kanalih FAM in HEX in je vrednost Ct ≤40, se lahko oceni, da je vzorec pozitiven na novi koronavirus 2019 (2019-nCoV).
7.3 Če ima preskusni vzorec jasno krivuljo pomnoževanja samo v enem kanalu FAM ali HEX in je vrednost Ct ≤40 in v drugem kanalu ni krivulje pomnoževanja, je treba rezultate ponovno testirati.Če so rezultati ponovnega testiranja skladni, se lahko oceni, da je vzorec pozitiven za novega
koronavirus 2019 (2019-nCoV).Če je rezultat ponovnega testiranja negativen, se lahko oceni, da je vzorec negativen na novi koronavirus 2019 (2019-nCoV).
Pozitivna vrednost presoje
Metoda krivulje ROC se uporablja za določitev referenčne vrednosti CT kompleta, referenčna vrednost notranje kontrole pa je 40.
Interpretacija rezultatov testa
1. Vsak poskus je treba testirati na negativne in pozitivne kontrole.Rezultate testiranja je mogoče določiti le, če kontrole izpolnjujejo zahteve nadzora kakovosti
2. Ko sta kanala zaznavanja FAM in HEX pozitivna, je lahko rezultat kanala CY5 (notranji kontrolni kanal) negativen zaradi sistemske konkurence.
3. Če je rezultat notranjega nadzora negativen, če so tudi kanali za zaznavanje FAM in HEX v epruveti negativni, to pomeni, da je sistem onemogočen ali da je delovanje napačno, t test ni veljaven.Zato je treba vzorce ponovno testirati.
